Déterminer le produit chimique qui vous souhaitez tester en utilisant la HPLC (le «analyte»). Par exemple, vous pourriez souhaiter pour tester une série de boissons gazeuses pour la teneur en fructose, dans ce cas, le fructose serait l'analyte.
Obtenir une quantité du produit chimique de pureté convenable de l'analyte. Normalement, la pureté doit être supérieure à 99% et l'analyte doit être acheté auprès d'une compagnie de bonne réputation de fournisseur de produits chimiques. Dans le cas de fructose, par exemple, vous souhaitez acheter fructose pur à partir d'un fournisseur de produits chimiques et non d'une épicerie.
Déterminer les maximales et minimales prévues des concentrations de l'analyte dans les échantillons que vous souhaitez afin de tester sur la HPLC. Dans le cas des boissons gazeuses, vous souhaitez examiner les étiquettes des boissons et de déterminer le contenu le plus bas et le fructose parmi les boissons que vous allez tester. Gardez à l'esprit que l'échantillon initial (la boisson gazeuse) peut être dilué ou autrement manipulés pendant la préparation pour l'analyse (en fonction de la méthode HPLC utilisé) et donc la concentration de l'analyte dans les échantillons effectivement injectés sur la HPLC peuvent être modifiés. Il est la concentration en analyte dans les échantillons comme la HPLC exécuté sur qui doit être considéré.
Déterminer le solvant dans lequel vous allez dissoudre votre analyte pour rattraper les normes d'étalonnage. Ce solvant doit être capable de se dissoudre correctement l'analyte sur une gamme relativement large de concentration (au moins aussi élevé que dans les échantillons que vous souhaitez tester). De plus, ce solvant devrait idéalement être assez similaire à la "phase mobile:" le solvant utilisé pour transporter les échantillons à travers l'instrument de HPLC.
Calculer la quantité d'analyte nécessaire pour faire une solution "mère de l'étalon" de l'analyte. Ceci est obtenu en multipliant la concentration requise de la norme d'actions par le volume souhaité. La concentration de l'analyte dans cette solution doit être d'au moins 10% plus élevée que la concentration de l'échantillon le plus élevé prévu. Si la concentration en fructose attendu le plus haut dans un échantillon de boisson gazeuse est de 8 grammes / 100 millilitres, la norme de stock pourrait être faite à une concentration de 10 grammes de fructose / 100 millilitres. Un volume raisonnable est 500 millilitres, ainsi 8/100 ml x 500 ml = 40 grammes de fructose serait nécessaire.
Peser la quantité requise d'analyte à un niveau approprié de précision. Souvent une valeur de poids en grammes précis à une ou deux décimales est approprié, mais plus de précision peut être nécessaire pour certaines méthodes.
Transférer l'analyte pesé dans une fiole jaugée du volume nécessaire et ajouter le solvant désiré à la marque de remplissage sur le flacon. Utilisation d'une fiole jaugée (plutôt que d'un gobelet gradué, par exemple) augmente la précision du stock valeur de concentration standard. Assurez-vous que tout l'analyte est transférée à l'utilisation flask- une partie du solvant à laver dans, le cas échéant.
Boucher la fiole jaugée et secouez doucement ou inverser jusqu'à l'analyte est complètement dissous.
Faites une série de différentes dilutions de l'étalon d'actions par le transfert de volumes connus de la norme de stock en fioles jaugées, en utilisant des pipettes pour un transfert précis, puis en ajoutant un solvant. La concentration étalon le moins devrait être prévue au-dessous de l'échantillon le plus faible à analyser. Dans l'exemple de boisson gazeuse, si la plus faible concentration en fructose attendue dans un échantillon est de 2 grammes / 100 ml, puis une norme / 100 ml de 1 gramme pourrait être faite. Ce serait faite par une dilution de dix fois de la norme de stock. La série de norme devrait inclure un total de 5 ou 6 concentrations, donc dilutions supplémentaires pour produire des normes de peut-être 3, 5 et 8 grammes de fructose / mL serait nécessaire. Vous avez maintenant une série de solutions standard avec qui pour calibrer la HPLC.